| 問題 | 可能原因 | 解決方法 |
| 無顏色 | 試劑孵育的時間沒有按說明書操作。 | 確定生物素化抗體，聯接的hrp試劑或鏈霉親和素-hrp使用的時間是否適當。 |
| 不同試劑盒或不同批號的試劑混用。 | 重新檢查試劑的標簽，確保所有組分都屬于正使用的試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。 | |
| 漏加酶 | 檢查操作流程，注意不要漏加 | |
| hrp酶污染了疊氮鈉 | 使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉 | |
| 標準品有問題（若在標本孔中有信號） | 按說明書檢查標準品的配制過程 使用1瓶新標準品 | |
| 某一容器未洗凈,殘留滅活酶物質 | 盡可能用試劑盒內容器,另覓一定要潔凈、可靠 | |
| 使用含血清的緩沖液配制/復溶抗體 | 重新確認所選用的試劑 | |
| .漏加顯色劑a或b | 加顯色劑后觀察孔中液面高度 | |
| 試劑配制/使用有誤 | 將實驗重做；嚴格按說明書操作，每次配制和使用前看清標簽。 | |
| 緩沖液污染 | 配制新鮮的緩沖液 | |
| 顯色弱 | 超過有效期的產品可能會產生很弱的信號。 | 檢查產品的有效期 |
| 加入試劑的體積和時間有誤 | 確定所使用的每一個試劑的體積正確和加入時間是適當。 | |
| 試劑、樣品用前未能平衡 | 用前試劑、樣品置室溫平衡10分鐘左右 | |
| 縮短孵育時間能使實驗的信號變弱。 | 檢查孵育的時間。 | |
| 在溫度變化的環境內孵育酶標板。 | 確定孵育的溫度，應避免溫度的變化。 | |
| 使用了被污染的試劑 | 檢查試劑是否被污染。 | |
| 標準品/標本制備方法不規范 | 檢查標準品/標本的制備，標準品應按說明書進行復溶和稀釋。低溫貯存的標本避免反復凍融，嚴禁使用溶血標本。樣品用nan3防腐,抑制了酶的反應 | |
| 顯色底物制備不規范 | 檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當充分。 | |
| 檢測時間不當 | 是否在規定的時間內檢測。 | |
| 儀器設定不正確，濾光片不匹配。 | 儀器是否設定正確，濾光片的選擇是否相符等。 | |
| 高背景（本底） | 洗滌操作不規范 | 洗板不充分，使用手工洗板常出現。使用洗板機，或使用洗瓶洗滌。每孔應*充滿洗滌緩沖液，傾出時應迅速。若使用洗板機，應校準并設定足夠充滿每孔的體積量。板的內側不應接觸設備。 檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量的體積是否準確。在兩次洗板之間加30秒的浸泡。 |
| 實驗中孵育溫度和時間不適當 | 確定每一實驗步驟的孵育溫度和時間是否適當 | |
| 酶加量過多 | 加酶前驗看移液器調節量是否準確。 檢查稀釋度，必要時需做效價測定試驗。 | |
| 封閉不* | 檢查封閉液的計算量；延長封閉時間。 | |
| 標本或標準品中的干擾物質 | 做適當的對照 | |
| 顯色劑受光照時間較長,或污染 | 顯色劑a和b應于使用前10分鐘從冰箱取出 | |
| 整批樣品放置時間過長,樣品污染 | 樣品應保持新鮮,或低溫保存,防止污染 | |
| 緩沖液污染 | 制備新鮮的緩沖液 | |
| 吸頭重復使用,未洗凈或消毒不*而用于加酶或顯色劑 | 吸頭盡可能一次性使用 | |
| 太多的信號： 全部的板子變成規則的藍色 | 不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒結合的過氧化物酶仍有殘留。 | 使用洗板機充分洗滌 檢查孔內是否有殘留的洗液或加樣量是否準確。 |
| 底物溶液混合太早并轉成藍色 | 應控制底物混合的時機并立即使用 | |
| 太多的酶結合物 | 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 | |
| 封板膜或試劑容器被重復使用，導致hrp殘留，使tmb底物產生非特異藍色。 | 使用新的封板膜，每步使用不同的試劑容器 | |
| 緩沖液中污染金屬或hrp | 制備新鮮緩沖液 | |
| 高cv值（cv：coefficient of variation），花板 | 操作不慎或洗滌不充分 | 按說明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述 |
| 出現干板，沒有使用封板膜、封板膜重復使用 | 確定每兩步驟間，酶標板應保持濕潤。 使用封板膜封口，注意每步使用新的封板膜。 | |
| 由于操作失誤或板子質量差（結合不均勻）造成包板不均勻。 | 稀釋用的pbs中不要加其它蛋白 檢查包被和封閉液體積、時間和試劑加入的方法。 檢查所使用的酶標板，使用elisa板（不要使用組織培養板） | |
| 移液器不準確，吸頭重復使用。 | 檢查并校準移液器。每次取樣必須換吸頭。回顧標本的加入步驟，確保每次加樣的準確性，保證吸取的液體按所設定的體積吸入和排出，連續加樣時注意檢查吸頭，確保所加液體的體積。 | |
| 樣品離心處理不全,反應孔內發生凝血或殘留細胞成分 | 標本充分離心, 3000rpm 6分鐘以上，嚴禁使用凝血（溶血）的標本 | |
| 緩沖液污染 | 制備新鮮的緩沖液 | |
| 標準曲線可得到，但兩點之間區別很差（低或平的曲線） | 酶結合物不足 | 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 |
| 捕獲抗體沒有很好結合到板上 | 檢查所使用的酶標板，使用elisa板（不要使用組織培養板） 稀釋用的pbs中不要加其它蛋白 | |
| 檢測抗體不足 | 檢查稀釋度，必要時進行效價測定 | |
| 板子顯色不足 | 延長底物孵育實驗 使用推薦品牌的底物溶液 | |
| 操作不慎 | 回顧elisa操作流程，消除任何擅自修改的程序。 | |
| 標準曲線稀釋度計算有誤 | 核查計算的情況，制備新的標準曲線 | |
| 標準曲線很好，但是沒有任何期望的陽性信號產生 | 在標本中無相應的細胞因子 | 使用內參對照 重復實驗，重新考慮實驗的相應參數 |
| 標本基質遮蓋檢測 | 將標本至少做1∶2相應的稀釋，或進行系列稀釋觀測它的恢復性 | |
| 標準曲線很好，但是標本的判讀值很高 | 標本中含的細胞因子水平超過檢測范圍 | 將標本做稀釋并再次實驗 |
| 當使用hrp酶結合物時，tmb底物加終止液后顯綠色 | 孔中的試劑顯色不充分 | 輕輕振蕩板子 |
| 邊緣效應 | 工作環境溫度不均衡 | 避免將酶標板在變化溫度環境中孵育 |
| 漂移 | 實驗過程中出現間斷 | 整個實驗應連續操作：在實驗開始前將所有標準品和標本做適當的準備 |
| 試劑沒有按說明書平衡至室溫 | 在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說明書中有另外的要求。 | |
| 是否可更改試劑盒 所提供的實驗操 作步驟？ | | 一般廠商為確保zui高的靈敏度和特異性，對試劑盒都進行了優化，為確保每一試劑盒實驗的規范性應按說明書操作。 |
| 是否可混用不同試劑盒中的試劑？ | | 不允許。絕大多數試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問題可與廠家或代理商。 |
| 是否可增加或減少標本的體積。 | | 商品化的試劑盒所需加入的標本體積是優化的，應按說明書操作，不建議更改所加標本的體積。 |
| 是否可重確定自己的標準曲線的點？ | | 可以。說明書上有建議的制備標準曲線時標準品的稀釋度，可改變稀釋倍數和增加曲線的點，但是必須在檢測范圍內，高于試劑盒中zui高標準品的點和低于靈敏度以下的點是無效的。 |
