GST瓊脂糖凝膠說明書
Glutathione-Triethyleneglycocyl-Sepharose 6B
目錄號：K0190
保存：20%乙醇中2-8 ℃保存
組分說明
Cat.No. K0190 K0190A
Volume 2ml 10ml
產品簡介
本產品為基于三甘醇（16 原子間隔臂）的谷胱甘肽瓊脂糖，可快速、溫和, 特異性地純化包含谷胱甘肽結合序列的非變性蛋白質，如谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、谷胱甘肽過氧化物酶等，尤其適用于在大腸桿菌、昆蟲細胞和哺育動物細胞中表達的GST 融合表達蛋白。該填料具有很好的物理和化學穩定性，使用壽命長，使用方便，批次重復性好，可一步分離得到純度較高的目標蛋白，純化條件溫和，可以保證蛋白的活性。
載量：5-10mgGST 標簽蛋白/ml 填料
支持物：CL-6B 瓊脂糖凝膠
粒徑：50-160 μm
注意事項
1. 請勿將GST凝膠冷凍、干燥和離心，整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。
2. 蛋白層析應使用高純度的試劑和水，層析前緩沖液應用 0.45µm 濾膜過濾后使用。另外為防止柱子阻塞，上柱前建議將裂解液進行離心，或者使用0.45µm 濾膜過濾。
3. GST 融合蛋白與還原型谷胱甘肽的結合比較緩慢，為獲得zui大結合量，上樣流速建議為：0.2-1ml/分鐘 (6ml 層析柱），0.5-2ml/分鐘（12ml 層析柱）。對于吸附效果不好的樣品，可以先把介質和樣品混合，輕輕振搖 2-4 小時，再裝柱，用平衡緩沖液進行重新平衡、洗脫等操作，另外在細菌抽提試劑中添加 5mMDTT，可以顯著提高 GST 標簽結合能力
4. 不同的GST融合蛋白取得zui佳純化效果所需還原型谷胱甘肽濃度、洗脫體積和洗脫時間可能有所不同。必要時需對流穿液、洗脫液進行 SDS-PAGE 以及 Western 雜交分析，以確定zui佳純化條件。
5. GST 融合蛋白以包涵體形式存在時不能與介質結合，必須先進行變性、復性、透析處理后才能用介質進行純化。建議優化蛋白表達條件盡量使蛋白可溶性表達。
6. 如后續實驗需要除去洗脫液中還原型谷胱甘肽，可采用超濾或透析的方法。
自備儀器和試劑
紫外蛋白監測儀、細菌蛋白抽提試劑盒、再生緩沖液1和再生緩沖液2
溶液配制
結合緩沖液（PBS）：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，pH7.4
洗脫緩沖液：10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4，140mMNaCl，2.7mMKCl，10mM還原型谷胱甘肽（GSH），pH7.4。將0.1g還原型谷胱甘肽（GSH）溶于30ml 結合緩沖液，或將0.25g 溶于75ml 結合緩沖液中。
再生緩沖液 1（自備）：0.1MTris-HCl，0.5MNaCl，0.1%SDS，pH8.5
再生緩沖液2（自備）：0.1MSodiumacetate，0.5MNaCl，0.1%SDS，pH4.5
操作步驟
樣本制備
1. 收集菌體后，每100 mg 菌體（濕重）加1-5 ml 細菌蛋白抽提試劑（每1 ml 細菌蛋白抽提試劑中加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），如有需要可以超聲裂解菌體。
注意：1） 當提取物粘度高時，建議加入DNaseI 和 Lysozyme。每1ml 細菌抽提試劑中加入1μlDNaseI（ 1 , 0 0 0 U / m l ），2 μ l L y s o z y m e（50mg/ml），DNaseI 和Lysozyme 可單獨從我公司購買，貨號：Lysozyme(#K0887)、 DNaseI(K2090A)，或直接從我公司購買K0888 細菌蛋白抽提試劑盒，包含細菌蛋白抽提試劑、DNaseI、Lysozyme 和蛋白酶抑制劑混合物。
2）超聲過程中保持菌液處于冰浴中，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類，容器的大小形狀，需實驗中自己摸索，應避免連續超聲導致溶液過熱，可分成短時間，多次超聲，zui終以菌液變清即可。
2. 10,000 rpm，4℃離心15 分鐘，將上清轉移至新的已預冷的離心管中，然后用預冷的 PBS Buffer 重懸沉淀(每50 ml裂解液的沉淀加入3mlPBS)。
3. 分別取10μl 上清和沉淀懸液進行SDS-PAGE 電泳檢測，以確定蛋白存在于上清或沉淀中。若目的GST 融合蛋白形成包涵體(不可溶蛋白)，應在純化以前以適當的方式進行溶解和重折疊。組裝層析柱
1. 將 GST-Agarose 填料混合均勻直至重懸，用吸管移取適量的填料至層析柱中。室溫靜置10 分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。
注意：1）填料的上層是乙醇保護液，將填料與乙醇一起混勻，以每 ml 填料純化 5-10mgGST 標簽蛋白計算，取需要的填料與乙醇混合液加入層析柱中。
2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個外力，例如用大拇指對柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。
3）本實驗都是通過重力作用使溶液流出。
2. 加入 5 倍柱體積的去離子水洗滌，再用10 倍柱體積的結合緩沖液平衡，平衡結束后即可上樣。
注意：柱體積指的是填料的體積。
GST 融合蛋白的純化
1. 將層析柱的出口連接上紫外蛋白監測儀，根據紫外蛋白監測儀觀察 280nm 處的吸收值來監控層析柱流出蛋白情況。
2. 上樣：將制備的蛋白樣品用結合緩沖液等體積稀釋后，加入到已平衡好的層析柱中，建議上樣流速為：0.5-1ml/min(6ml 層析柱），1-2ml/min（12ml 層析柱）。觀察 280nm 吸收情況并收集流穿蛋白。
注意：1）樣品在上柱前可以離心或 0.45μm 微孔濾膜過濾?；蛘呤褂帽驹噭┖兄懈綆У囊粔K篩板，使用時先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質較多的蛋白的過濾，防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用。再將處理好的樣品負載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出。
2）通過控制加入的菌體裂解液的速度或流出速度來控制柱流速，流速過快會影響柱效。
3. 洗滌：使用10 倍柱體積的結合緩沖液過柱，洗滌雜蛋白，觀察 280nm 吸收情況并收集雜蛋白。建議洗滌流速為：0.5-1ml/min(6ml 層析柱），1-2ml/min（12ml 層析柱）。
注意：建議洗滌液中加入蛋白酶抑制劑終濃度為1mM，如蛋白酶抑制劑混合物，以抑制蛋白酶活性。
4. 洗脫：使用10-15 倍柱體積的新鮮配制的洗脫緩沖液過柱，洗脫目的蛋白，觀察 280 nm 吸收情況并收集目的蛋白。
建議洗滌流速為0.5-1ml/min(6ml 層析柱），1-2ml/min（12ml 層析柱）。
5. 蛋白檢測：分別取等量的流穿液，洗滌液和目的蛋白洗脫液進行 SDS-PAGE 以分析蛋白的層析情況。
6. 洗脫后，依次用3-5 倍柱體積的結合緩沖液和3-5 倍柱體積的去離子水洗滌填料，再用 2-3 倍柱體積的20%乙醇洗滌（乙醇要將填料浸沒），4℃保存。
柱再生
當填料使用多次后，結合效率會有下降，可用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。
1. 使用 5 倍柱體積的再生緩沖液 1 洗滌填料，而后用5-10 倍柱體積超純水洗滌。
2. 使用 5 倍柱體積的再生緩沖液2 洗滌填料，而后用5-10 倍柱體積超純水洗滌。
3. 保存：使用2-3 倍柱體積的20%乙醇洗滌，將層析柱的頭尾密封后（乙醇要將填料浸沒）4℃保存。
4. 再次使用時加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇洗滌后，使用10 倍柱體積的結合緩沖液平衡填料，平衡結束后即可上樣。
問題與方法
1. 蛋白產量低
原因：
a低表達量
b融合蛋白為包涵體
c裂解不充分
d融合蛋白與介質結合能力差
e流速過快
解決方法：
a優化表達條件
b優化細菌培養條件（如：降低溫度，改變誘導條件） c充分裂解細胞
d融合的伴侶蛋白改變了GST 空間構象，影響了結合能力。純化前，在細菌蛋白抽提試劑中添加5mMDTT，可以顯著提高GST 標簽結合能力。
e降低上樣樣品流速
2. 蛋白純度低
原因：
a洗滌不充分
b融合蛋白樣品中含其他細菌蛋白
解決方法：
a增加洗滌量：在洗滌液中中添加0.05%NP-40 或提高鹽濃度。
b純化前，在細菌蛋白抽提試劑中添加5mMDTT，減少非特異性吸附。
3. 柱流速緩慢
原因：
柱超載
解決方法：
降低樣品上樣量或流速
4. 柱壓力過高
原因：
細胞碎片堵柱
解決方法：
離心樣品，或用0.45μm濾膜過濾
實驗代做服務：
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